Le Purine influenzano numerosi processi cellulari vitali, agendo sia a livello intracellulare (metabolismo energico e sintesi del DNA) che a livello extracellulare (molecole di segnale che, attraverso i loro recettori, modulano processi di maturazione, differenziazione o degenerazione neoplastica di differenti tipi di cellule e le principali funzioni di diversi sistemi e apparati come il SNC, l'apparato gastro-enterico, quello respiratorio e il sistema immunitario). L'armonico funzionamento del sistema purinico è assicurato dall'attività integrata di un gruppo di enzimi che regolano la formazione e il metabolismo di questi composti. Sebbene numerose evidenze sperimentali abbiano chiarito le caratteristiche fisico-chimiche, biochimiche e funzionali di diversi enzimi di questo gruppo, molto resta da capire sul ruolo e sulle interazioni funzionali di quegli enzimi che controllano la trasformazione dei nucleotidi monofosfati in nucleosidi e di questi nelle rispettive nucleobasi. Il metabolismo intracellulare delle purine segue due vie. La prima, più nota, è specifica per le purine adeniniche e prevede la trasformazione dell'AMP in Adenosina (ADO), Inosina (INO) e Ipoxantina (HYPO) grazie all'attività delle 5'-Nucleotidasi citosoliche (5'NT), Adenosina deaminasi (ADA) e purina-nucleoside-fosforilasi(PNP). Essa garantisce la formazione di alte quantità di ADO che, oltre che essere utilizzata nella classica via di salvataggio delle purine,
è anche coinvolta nel ciclo della S-adenosil-metionina (SAM), nella formazione di poliamine e nei meccanismi di riparazione del DNA. Disfunzioni degli enzimi che regolano la quantità di ADO intracellulare (ADA e/o S-adenosil-omocisteina idrolasi - SAHH), inducono danno cellulare e morte apoptotica. La seconda via, meno studiata, prevede la trasformazione dell'AMP e GMP in IMP, INO, Guanosina (GUO), HYPO e Guanina (GUA) grazie all'attività della AMP deaminasi (AMPDA), della nucleotidasi citosolica II (cN-II) e, di nuovo, della PNP. Essa esclude la formazione di ADO e coinvolge, in uguale misura, le purine adeniniche e guaniniche. A livello extracellulare dove sono rilasciati ATP e GTP, in condizioni fisiologiche, si dosano considerevoli quantità di AMP, IMP, GMP, INO, GUO, HYPO e GUA, ma non di ADO, grazie al rapido breakdown dell'ATP e GTP rilasciati, assicurato dall'attività di alcuni enzimi, uguali o simili ai loro corrispondenti intracellulari, ancorati sulle membrane cellulari (ecto-enzimi) o rilasciati nel mezzo extracellulare. I livelli molto bassi di ADO con elevate ed equivalenti quantità di INO e GUO
suggeriscono che a livello extracellulare la seconda via metabolica sia quella preferita anche se non esistono sufficienti evidenze a favore della presenza di ecto-AMPDA, ecto-cN-II, ecto-PNP ed ecto-HYPO-GUA-fosforibosiltransferasi (ecto-HGPRT) o di un rilascio di questi enzimi. Peraltro, è noto che questi enzimi regolano l'attivazione e metabolizzazione di analoghi purinici e pirimidinici ad attività antineoplastica e che loro disfunzioni producono gravi alterazioni nel ciclo cellulare così come nei processi di maturazione e differenziamento cellulare, principalmente nel SNC e quello immunitario come nella sindrome di Lesch-Nyhan, legata ad un deficit genetico della HGPRT, e nella sindrome da immunodeficienza associata a carenza di PNP.
Grazie alla disponibilità di nuovi potenziali farmaci, strumenti biotecnologici e opportuni modelli cellulari (già messi a punto dalla UR di Chieti in collaborazione con colleghi operanti nelle Università di Pisa, Napoli, Ferrara, Siena e Bologna) quali un inibitore della PNP di recente sintesi, PNP da Archaea ipertermofili e linee cellulari con normale espressione, sovraespressione stabile o transitorio silenziamento di alcuni enzimi (PNP, cN-II e HGPRT), il Progetto si propone di contribuire a migliorare le conoscenze sul ruolo fisiopatologico e farmacologico di AMPDA, cN-II,
PNP e Guanasi. Nei modelli cellulari menzionati sarà valutata la presenza dei suddetti enzimi sia a livello intra- che extra-cellulare, i loro livelli di espressione così come la cinetica delle loro attività, in assenza e in presenza del nuovo inibitore della PNP. Parallelamente, sarà anche valutato come i livelli di espressione o l'inibizione dei suddetti enzimi modifichino il pattern delle purine intra- ed extra-cellulari, così come la loro capacità di modulare il ciclo cellulare, la vitalità, il fenotipo (Transizione epitelio-mesenchimale -EMT), la morte cellulare, la produzione di ROS e il rilascio di glutammato/glutamina misurati in condizioni normali e in presenza di Deprivazione di Glucosio e Ossigeno - OGD). Infine l'uso dei menzionati modelli cellulari con espressione variabile di cN-II e PNP combinato con la valutazione dell'attività biocatalizzatrice delle PNP ricombinanti da Archaea ipertermofili fornirà utili indicazioni per lo sviluppo di nuovi pro-farmaci analoghi purinici e pirimidinici con attività antitumorale e ridotta tossicità sistemica.
è anche coinvolta nel ciclo della S-adenosil-metionina (SAM), nella formazione di poliamine e nei meccanismi di riparazione del DNA. Disfunzioni degli enzimi che regolano la quantità di ADO intracellulare (ADA e/o S-adenosil-omocisteina idrolasi - SAHH), inducono danno cellulare e morte apoptotica. La seconda via, meno studiata, prevede la trasformazione dell'AMP e GMP in IMP, INO, Guanosina (GUO), HYPO e Guanina (GUA) grazie all'attività della AMP deaminasi (AMPDA), della nucleotidasi citosolica II (cN-II) e, di nuovo, della PNP. Essa esclude la formazione di ADO e coinvolge, in uguale misura, le purine adeniniche e guaniniche. A livello extracellulare dove sono rilasciati ATP e GTP, in condizioni fisiologiche, si dosano considerevoli quantità di AMP, IMP, GMP, INO, GUO, HYPO e GUA, ma non di ADO, grazie al rapido breakdown dell'ATP e GTP rilasciati, assicurato dall'attività di alcuni enzimi, uguali o simili ai loro corrispondenti intracellulari, ancorati sulle membrane cellulari (ecto-enzimi) o rilasciati nel mezzo extracellulare. I livelli molto bassi di ADO con elevate ed equivalenti quantità di INO e GUO
suggeriscono che a livello extracellulare la seconda via metabolica sia quella preferita anche se non esistono sufficienti evidenze a favore della presenza di ecto-AMPDA, ecto-cN-II, ecto-PNP ed ecto-HYPO-GUA-fosforibosiltransferasi (ecto-HGPRT) o di un rilascio di questi enzimi. Peraltro, è noto che questi enzimi regolano l'attivazione e metabolizzazione di analoghi purinici e pirimidinici ad attività antineoplastica e che loro disfunzioni producono gravi alterazioni nel ciclo cellulare così come nei processi di maturazione e differenziamento cellulare, principalmente nel SNC e quello immunitario come nella sindrome di Lesch-Nyhan, legata ad un deficit genetico della HGPRT, e nella sindrome da immunodeficienza associata a carenza di PNP.
Grazie alla disponibilità di nuovi potenziali farmaci, strumenti biotecnologici e opportuni modelli cellulari (già messi a punto dalla UR di Chieti in collaborazione con colleghi operanti nelle Università di Pisa, Napoli, Ferrara, Siena e Bologna) quali un inibitore della PNP di recente sintesi, PNP da Archaea ipertermofili e linee cellulari con normale espressione, sovraespressione stabile o transitorio silenziamento di alcuni enzimi (PNP, cN-II e HGPRT), il Progetto si propone di contribuire a migliorare le conoscenze sul ruolo fisiopatologico e farmacologico di AMPDA, cN-II,
PNP e Guanasi. Nei modelli cellulari menzionati sarà valutata la presenza dei suddetti enzimi sia a livello intra- che extra-cellulare, i loro livelli di espressione così come la cinetica delle loro attività, in assenza e in presenza del nuovo inibitore della PNP. Parallelamente, sarà anche valutato come i livelli di espressione o l'inibizione dei suddetti enzimi modifichino il pattern delle purine intra- ed extra-cellulari, così come la loro capacità di modulare il ciclo cellulare, la vitalità, il fenotipo (Transizione epitelio-mesenchimale -EMT), la morte cellulare, la produzione di ROS e il rilascio di glutammato/glutamina misurati in condizioni normali e in presenza di Deprivazione di Glucosio e Ossigeno - OGD). Infine l'uso dei menzionati modelli cellulari con espressione variabile di cN-II e PNP combinato con la valutazione dell'attività biocatalizzatrice delle PNP ricombinanti da Archaea ipertermofili fornirà utili indicazioni per lo sviluppo di nuovi pro-farmaci analoghi purinici e pirimidinici con attività antitumorale e ridotta tossicità sistemica.